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　　本文节选自来自Amgen的研究人员发表的文章“Automized inline monitoring in perfused mammalian cell culture by MIR spectroscopy without calibration model building”，详细内容，请参考原文。

　　过程分析技术 (PAT) 在生物制药行业的自动化进程中发挥着关键作用。近年来，拉曼光谱或中红外 (MIR) 光谱等光谱方法由于能够同时测量各种分子，因此在生物过程的入线（inline）监测方面越来越受到认可。然而，它们对费力的模型校准的依赖使它们的实施面临挑战。在这项研究中，采用两种不同规模和四种不同产物的 22 个哺乳动物细胞灌流 (PER) 工艺对一种新颖的单点校准进行了评估，该校准在使用 MIR 光谱法入线监测生物过程中的葡萄糖和乳酸之前需要一个参考点。对所有 PER 运行的浓度进行预测，葡萄糖的均方根误差 (RMSE) 为 0.29 g/L，乳酸为 0.24 g/L。为了进行比较，使用了传统的偏最小二乘回归（PLSR）模型，并使用来自两个不同规模和三种产物的六个生物反应器运行的光谱数据进行训练。这些模型的总体精度（葡萄糖的 RMSE 为 0.41 g/L，乳酸的 RMSE 为 0.16 g/L）在单点校准的精度范围内。这表明了单点校准作为一种使光谱学更容易用于生物过程开发的方法的潜力。

　　全球制药市场是一个快速变化且高度创新的行业。过去十年来，加速产品开发的需求不断增加。2004 年，美国食品和药物管理局 (FDA) 启动了过程分析技术 (PAT) 倡议，以保证产品的稳健性和高质量。市场提供了不同的专用传感器，用于持续监控关键工艺参数 (CPP)，确保在生物制药制造过程中对产物质量属性进行一致控制。对生物过程自动化和数字化的关注需要足够的 PAT 解决方案来实现自动化入线监测和控制策略。

　　用于监测 CPP 的常用传感器包括 pH 值、温度和溶氧等。然而，进一步的 CPP（如代谢物或营养物浓度）的测量大多以每日离线样品分析的形式进行。由于与这种方法相关的生物过程信息量有限，适当对策的执行和获得更深入的过程理解受到高度限制。拉曼光谱或红外光谱等光谱方法是用于详细在线或入线监测 CPP 的有前景的工具，因此有助于更好地理解和控制生物过程。这些非侵入性方法不需要样品制备，并且可以与生物反应器 (BR) 一起轻松灭菌，使其成为入线传感器的理想选择。光谱技术可以同时预测营养物和代谢物。近红外、中红外 (MIR) 和拉曼光谱已充分证明了在中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞培养中葡萄糖和乳酸的入线监测的能力。基于这些方法的控制策略可以优化产物滴度、细胞生长和糖基化模式。

　　广泛使用光谱方法的障碍是成本高、缺乏一次性组件以及依赖于费力的校准模型构建，这非常耗时并且需要化学计量学方面的专业知识来进行数据评估。校准模型通常依赖于校准设置的操作条件。对可靠校准模型的需求是光谱方法在生物制药领域广泛使用的最大挑战之一。为了使用偏最小二乘回归 (PLSR) 等标准多元方法构建稳健的模型，需要大量数据集、光谱学方法和数据分析知识。这需要增加个人、产物和时间资源。此外，大多数模型的预测和准确性高度依赖于数据集和所使用的模式，因此通常不可转移。减少大量校准模型构建和数据生成工作量的潜在策略是使用通用校准模型来预测改变细胞系、培养基和操作设置的参数。然而，这些算法需要来自多个批次和模式的大量数据来构建模型。

　　在本研究中，开发了使用 MIR 光谱法直接入线监测 CHO 灌流 (PER) 过程中的葡萄糖。对于生物过程中的两种主要成分（葡萄糖和乳酸），创建并测试了一种仅需要一个初始参考点的新型单点校准。为了评估其稳健性，使用一种表达四种不同产物、两种不同规模的细胞系对该方法进行了评估，并与常规 PLSR 模型进行了比较。由于葡萄糖和乳酸在细胞培养过程中的重要性，因此选择葡萄糖和乳酸作为单点校准的参数。本研究的目标是开发并提出一种基于 MIR 光谱的简单即用型方法，用于 CHO PER 工艺，无需事先了解光谱学知识即可使用。

　　PER 工艺可以通过三个过程步骤来定义。第一阶段是为期 3 天的细胞积累批次阶段。在第二个 9 天阶段，交替式切向流 (ATF) 过滤系统（Repligen）连接聚砜过滤器（Cytiva）和化学限定培养基（PER-Medium），用于提高细胞密度和积累产物。收集的滤液不含细胞和产物（废物）。灌流速率逐渐增加至每天最多 1 个 BR 体积 (RV/d)。在第三阶段，在灌流细胞培养过程的第 12-15 天，使用切向流过滤收获产物。第 12 天，ATF 过滤器从 30 kDa 截留膜切换为 750 kDa 膜，允许产物通过膜，同时细胞仍截留在反应器中。除了 PER-Medium 之外，还根据需要将 50% 葡萄糖溶液添加到 BR 中，以将葡萄糖水平保持在临界浓度以上。

　　使用 2 L 生物反应器运行的单点校准模型（分子 C）预测整个过程中葡萄糖和乳酸浓度（以 g/L 为单位）。单点校准预测由红线（葡萄糖）和黑线（乳酸）表示。对于两条线，都包括单点校准的预测不确定性，该不确定性计算为所有 22 次运行的均方根误差 (RMSE)。使用 Cedex Bio HT 测量葡萄糖浓度（红色三角形和乳酸（黑点））的参考值。显示灌流速率（蓝色虚线）、温度变化（绿色虚线）和推注补料（绿色箭头）的变化。第12天进行了交替式切向流（ATF）切换，因当天数据不足，暂停了该工艺的监测，并于第13天以早上的样本重新开始监测。

　　在本研究中，深入研究了一种使用 MIR 光谱系统 Monipa 的新型单点校准方法，并将其性能与标准多元方法 PLSR 进行了比较。在 22 次运行中对葡萄糖和乳酸的浓度进行了入线监测，规模和产物各不相同。结果表明，在准确性和稳健性方面，其性能与 PLSR 方法相当。此外，没有发现变化的条件对该方法的准确性产生显著影响，证明其能够作为实时监测 CHO PER 过程的通用方法。所提出的单点校准有助于减少 PAT 技术在生物过程中的实施障碍。该算法利用中红外光谱的特性来降低技术的复杂性。这种方法与强大的中红外光谱仪相结合，有可能使光谱学更适用于化学计量知识较少的用户，从而可能有助于该技术在行业中得到更广泛的应用。它可以帮助降低材料和劳动力成本，因为它不依赖于之前的测试运行来收集模型构建数据。MIR 光谱系统 Monipa 可直接用于工艺开发，这可能有助于使其在早期开发中更加有用。在生产过程中，该方法可以成为稳健的葡萄糖控制的可靠基础。由于葡萄糖浓度的变化将被实时连续监测，因此该信息可以帮助优化补料策略，例如，通过将葡萄糖进料与反应器中的乳酸浓度相结合。

　　然而，实际上，单点校准取决于可靠的永利集团科技有限公司参考分析或已知的初始浓度。因此，科学家应该了解参考分析的标准偏差，以了解其过程的上限和下限。